siRNA介导的PD-L1沉默可增强人CD8<sup>+</sup>T淋巴细胞的体外杀伤作用
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  南方医科大学学报  2018, Vol. 38Issue (7): 800-806  DOI: 10.3969/j.issn.1673-4254.2018.07.05.
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王震, 黄文, 岑柏宏, 魏媛怡, 廖路敏, 黎国仙, 季爱民. siRNA介导的PD-L1沉默可增强人CD8+T淋巴细胞的体外杀伤作用[J]. 南方医科大学学报, 2018, 38(7): 800-806. DOI: 10.3969/j.issn.1673-4254.2018.07.05.
WANG Zhen, HUANG Wen, CEN Bohong, WEI Yuanyi, LIAO Lumin, LI Guoxian, JI Aimin. Small interfering RNA-mediated programmed cell death-ligand 1 silencing in human glioma cells enhances human CD8+ T lymphocyte cytotoxicity in vitro[J]. Journal of Southern Medical University, 2018, 38(7): 800-806. DOI: 10.3969/j.issn.1673-4254.2018.07.05.

基金项目

国家自然科学基金(81370449);广州市科技计划项目产学研协同创新重大专项(201504291720212);广东省省级科技计划项目(2013B091300014)

作者简介

王震,硕士,E-mail: 491320443@qq.com

通信作者

季爱民,教授,主任药师,博士生导师,E-mail: aiminji_007@163.com

文章历史

收稿日期:2018-01-07
siRNA介导的PD-L1沉默可增强人CD8+T淋巴细胞的体外杀伤作用
王震 1,2,4, 黄文 1, 岑柏宏 1, 魏媛怡 1, 廖路敏 1, 黎国仙 1, 季爱民 1,2,3     
1. 南方医科大学珠江医院药剂科,广东 广州 510282;
2. 南京制药厂有限公司新药研发中心,江苏 南京 210007;
3. 广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤放射中心,广东 广州 510095;
4. 邵阳市中心医院药剂科,湖南 邵阳 422000
摘要: 目的 设计并筛选多条可高效特异性降低肿瘤细胞表面沉默程序性死亡受体-配体1(PD-L1)表达的小干扰RNA(siRNA)序列,并研究其增强人CD8+T淋巴细胞对人胶质瘤细胞(U87 MG)免疫杀伤作用。方法 根据siRNA设计法则,并通过siDirect软件在线设计针对PD-L1基因的几种不同的siRNA序列,并运用BLAST进行同源性分析,最终确定候选序列;通过RT-qPCR、Western blot及流式细胞术实验,选出高效抑制PD-L1 mRNA及蛋白表达的siRNA序列;通过流式细胞术及CCK8检测PD-L1 siRNA沉默U87 MG细胞的PD-L1后,人CD8+T细胞对U87 MG的细胞凋亡及增殖的影响。结果 设计了10条针对人PD-L1基因具有不同核苷酸序列的siRNA。采用RT-qPCR、Western blot及流式细胞术在mRNA及蛋白水平上检测siRNA的沉默效率,与对照组相比,siPD-L1-1、siPD-L1-2、siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8均显著降低U87 MG中PD-L1基因的表达(P < 0.05),其中siPD-L1-3的沉默效率最高。与对照组相比,流式细胞术及CCK8结果显示,siPD-L1-3及siPD-L1-8均可显著增强人CD8+T细胞对U87 MG细胞的杀伤作用,且该杀伤作用可显著抑制U87 MG细胞增殖(P < 0.05)。结论 本文设计并筛选了能有效沉默PD-L1基因表达的siPD-L1-1、siPD-L1-2、siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8的6条序列,其中siPD-L1-3和siPD-L1-8可高效增强T淋巴细胞对U87 MG细胞免疫杀伤作用,且siPD-L1-3的作用最为显著。本文设计的PD-L1 siRNA分子可以用于设计和制备预防、治疗多种癌症的核酸药物。
关键词: 程序性死亡受体-配体1    小干扰RNA    神经胶质瘤细胞    CD8+T细胞    核酸药物    
Small interfering RNA-mediated programmed cell death-ligand 1 silencing in human glioma cells enhances human CD8+ T lymphocyte cytotoxicity in vitro
WANG Zhen1,2,4, HUANG Wen1, CEN Bohong1, WEI Yuanyi1, LIAO Lumin1, LI Guoxian1, JI Aimin1,2,3     
1. Department of Pharmacy, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, China;
2. R&D Center, Nanjing Pharmaceutical Factory Co., Ltd., Nanjing 210007, China;
3. Department of Radiation Oncology, Affiliated Cancer Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510282, China;
4. Department of Pharmacy, Shaoyang Central Hospital, Shaoyang 422000, China
Supported by National Natural Science Foundation of China (81370449)
Abstract: Objective To investigate the effect of small interfering RNA (siRNA)-mediated silencing of programmed cell deathligand 1 (PD-L1) in human glioma cells on the cytotoxicity of human CD8+T lymphocytes against the modified tumor cells. Methods A siRNA sequence targeting PD-L1 gene was designed and transfected into human glioma U87 MG cells via lipofectamine 2000, and the gene silencing effect was validated using RT-qPCR, Western blotting, and flow cytometry. The transfected cells were co-cultured with human CD8+T lymphocytes, and the apoptosis of the tumor cells was analyzed with flow cytometry. Results The siRNA sequence showed strong PD-L1 gene-silencing effect at both mRNA and protein levels in U87 MG cells. Compared with the control cells, the transfected U87 MG cells showed significantly increased vulnerability to the cytotoxicity of human CD8+T cells and an obvious reduction of proliferative activity in the co-culture (P < 0.05). Conclusion Transfection of human glioma U87 MG cells with the specific siRNA targeting PD-L1 obviously enhances the toxicity of human T lymphocytes in the co-culture.
Key words: programmed cell death-ligand 1    small interfering RNA    gliomas    CD8+ T lymphocytes    

目前,FDA批准上市的针对PD-L1的单克隆抗体有Atezolizumab [1]、Avelumab [2]及Durvalumab [3]。PD-L1抗体药物具有较好的疗效,副作用相对化疗药物较小[4]。但仍存在着免疫毒副作用,且容易因靶蛋白突变而产生耐药性[5-6]。因此,需要在更高水平如mRNA或DNA水平以靶向抑制PD-L1,降低毒副作用及耐药机率,增强抗肿瘤效应。

RNA干扰(RNAi)技术是基因功能的研究和疾病的基因治疗的重要工具[7-8]。目前关于针对PD-L1靶点的siRNA药物研究较少[9],如将针对PD-L1基因的siRNA制备成具有肿瘤靶向性三元复合物[10],纳米粒[11-12],胶束[13]等,可特异性的沉默肿瘤细胞中PD-L1基因表达,激活T淋巴的杀伤作用,抑制肿瘤细胞增殖。与抗体药物相比,siRNA药物可从mRNA水平特异性沉默PD-L1蛋白的表达,除了具有抗体药物药效外,还可避免因PD-L1蛋白突变而失效的发生,此外构建肿瘤靶向载体给药,可有效降低其他器官的免疫毒副作用[14-15]。因此,在mRNA水平抑制PD-L1蛋白的siRNA药物,可单独或联合现有抗体药物使用,具有极大的治疗肿瘤的潜力。

siRNA序列具有碱基序列特异性及双链退火温度(Tm)差异性,针对相同靶基因设计的不同siRNA序列,其沉默效率、脱靶效应及免疫原性等存在差异[16-17]。因此,设计并得到高效的siRNA序列是开发RNAi药物的基础。本研究首先通过计算机辅助设计了多条靶向PD-L1 mRNA的候选siRNA序列,然后通过RT-qPCR、流式细胞术及Western blot实验,在基因和蛋白水平筛选出能高效特异性沉默U87 MG细胞中PD-L1 mRNA表达的最佳序列。进一步应用流式细胞术及CCK-8实验验证了CD8+T细胞对经最佳siRNA序列转染后U87 MG细胞的凋亡及增殖的影响,为基于PD- L1 siRNA序列的肿瘤疗法的研究奠定了基础。

1 材料和方法 1.1 材料

胎牛血清、DMEM培养基等均购自Gibco。siRNA及引物由广州锐博公司合成。Trizol试剂,转染试剂Lipofectamine 2000、opti-MEM等均购自Invitrogen。逆转录试剂盒,实时定量荧光(Real-time)PCR相关试剂购自日本TakaRa。PD-L1 Monoclonal Antibody(MIH5)-PE购自Ebioscience。Anti-human PD-L1(17952-1-AP)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗,购自Proteintech。PVDF膜购自Millipore。CCK 8试剂盒购自日本同仁化学公司。细胞凋亡检测试剂盒购自广州杰特伟生物科技有限公司。CD8+T细胞分离试剂盒购自德国美天旎公司。

1.2 仪器

ABI 7500实时定量PCR仪:美国Life;超净工作台(JW-CJ-1F):苏州净化设备厂;IX71型倒置显微镜:日本Olympus;Galaxy S型CO2培养箱:英国Galaxy R;5810 R型高速离心机:德国Eppendorf;FACSCalibur流式细胞仪:美国BD;Mini电泳槽:Amershem。

1.3 方法 1.3.1 设计沉默PD-L1基因的siRNA序列

根据Tuschl等[18]提出的siRNA设计规则在所选基因的启动子100个碱基以后开始设计;正义链的GC含量应为30%~ 50%;正义链的第1个碱基必须为G或C;正义链的第10个碱基是U;正义链的第13个碱基不能是G;正义链的第19个碱基不能是G或C应尽量避免出现稳定的发夹型二级结构,并运用BLAST在Genbank中进行同源性分析。根据siRNA的设计原则,采用siDirect软件设计,获得针对PD-L1基因(序列号NM_001141351.1)表达的不同核苷酸序列的siRNA。运用BLAST进行同源性分析,在Genbank中进行BLAST,确定序列无误并且与其它基因不存在同源性,最终确定序列,由广州市锐博生物科技公司合成。

1.3.2 人神经胶质瘤细胞系培养

人神经胶质瘤细胞系(U87 MG),购置于ATCC。U87 MG细胞贴壁生长于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中,培养条件为37 ℃、5% CO2,2 d换液1次,4 d传代1次。

1.3.3 实验分组

实验组:加入含siPD-L1-1~10与Lipofectamine 2000转染混合物,siRNA终浓度为100 nmol/L。阳性对照组:以专利(专利号US20170067060)中的沉默PD-L1基因的siRNA序列(siPD-L1-PC)为阳性对照。加入含siPD-L1-PC与Lipofectamine 2000转染混合物,siRNA终浓度为100 nmol/L。阴性对照组:加入与人转录组无同源性的siRNA序列(siNC),siRNA终浓度100 nmol/L。空白对照组(Control):只加入Lipofectamine 2000转染试剂。每组设3个复孔。

1.3.4 对U87 MG细胞进行siPD-L1的转染

取对数生长期的细胞,接种于12孔板中,5×104/孔。待细胞贴壁后,移去完全培养基,用PBS洗2遍,每孔加入400 μL Opti-MEM。按照实验分组,每组分别将3 μL的lipofectamine 2000加入150 μL的Opti-MEM中,将7.5 μL siRNA加入150 μL的Opti-MEM中,室温下放置5 min后,混合,室温孵育15 min,配置成转染液。每组3个复孔,每孔加100 μL转染液,置于37 ℃,5% CO2孵箱中培养。培养12 h后换液,继续培养36 h后检测转染效率。

1.3.5 RT-qPCR法检测U87 MG细胞PD-L1 mRNA表达水平

收集转染后的细胞样本,参照Trizol试剂盒说明书,每个样品孔中加入1 mL细胞裂解液(Trizol),充分裂解后,将细胞裂解液吸至无菌去酶的EP管中。每支EP管中加入200 μL氯仿,剧烈振荡15 s,静置10 min。4 ℃,12 000 g/min离心15 min。吸取上层的水相,转至另一EP管中。加入200 μL异丙醇,轻轻颠倒混匀,于静置放置10 min。4 ℃,2000 g/min离心15 min,可见RNA白色沉淀。弃上清,加入l mL 75%乙醇,清洗沉淀后,每支EP管中加入适当DEPC水溶解沉淀,测定RNA的浓度和纯度。

按照反转录配置反应液:5 × PrimeScript@ RT Master Mix for Real Time*1 2 μL,RNase Free dH2O 6 μL,样品2 μL。按以下条件反转录成cDNA,37 ℃ 15 min→85 ℃ 5 s→4 ℃。

用Primer primier 5软件设计PD-L1引物进行RTPCR检测。

PD-L1引物序列:正向5'-TGTACCGCTGCATGATCAG-3';

反向5'-AGTTCATGTTCAGAGGTGACTG-3';

GAPDH引物序列:正向5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3';

反向5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。

按下列组成配置PCR反应液:SYBR premix Ex Tap Ⅱ(2×)(10 μL),ROX Reference Dye(50×)(0.4 μL),Primer F/R(0.8 μL, 10 μmol/L),sample cDNA(2 μL),RNase Free dH2O(6 μL)。混匀后按以下条件进行PCR反应:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s。40个循环,然后进行数据分析:各目的基因表达水平的变异用变化倍率2-△△Ct以计算来表示。

1.3.6 Western bolt法检测U87 MG细胞PD-L1蛋白表达水平

把siPD- L1-NC、siPD-L1-PC、siPD- L1-3、siPD-L1-5和siPD-L1-8分别转染细胞后,提取转染各组细胞的总蛋白:转染72 h后弃去培养基,用预冷的PBS洗细胞2~3次。加入RIPA蛋白提取试剂(每个皿中加入RIPA裂解液200 μL和PMSF 20 μL),于冰上裂解30 min(不断晃动使裂解充分)。用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶一侧,然后将细胞碎片和裂解液移至1.5 mL离心管中,整个操作在冰上进行。于4 ℃,12 000×g离心15 min,将离心后的上清液转移至0.5 mL的干净无菌离心管中,BCA法测蛋白含量。各样品组上样量相同,进行Western blotting检测:SDS-PAGE电泳分离蛋白,将凝胶上的蛋白用湿法转移到PVDF膜上,用5%牛血清白蛋白封闭PVDF膜上不含目的蛋白的结合位点,然后用anti-human PD-L1(17952-1-AP, proteintech)的抗体(一抗)处理,接着再用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗与一抗结合。用ECL显影。

1.3.7 流式细胞术检测U87 MG细胞表面PD-L1的蛋白表达水平

U87 MG细胞分别经lipofectamine 2000转染siNC,siPD-L1-PC、siPD-L1-1~10后,将上述各组实验样本用PBS洗涤2次,消化(1000 r/min离心5 min)收集细胞,加入100 μL PBS悬浮细胞后,加入5 μL PD-L1抗体混匀后,于4 ℃在避光条件下反应30 min。反应完全后,离心,去除抗体,用PBS洗2遍后,用200 μL PBS重悬细胞,上机检测。

1.3.8 人CD8+T细胞的提取分离(CD8磁珠阳性选择富集CD8+T细胞)

80 μL PBMCs+20 μL CD8磁珠,混匀,4 ℃冰箱孵育15 min;加1~2 mL PBS(含1% FCS),1800 r/min,离心5 min,PBS(含1% FCS)重悬细胞,调整细胞密度为1×108/mL(备用);将分选柱置于磁铁上,预先用3 mL PBS(含1% FCS)冲洗分选柱(LS),保持分选柱湿润,将上述细胞悬液过柱,细胞悬液不中断,过柱后3 mL PBS(含1% FCS)洗3遍;取下分选柱,分选柱内加5 mL PBS(含1% FCS),用推头推出分选柱内液体并收集,所收集液体即为CD8+T细胞悬液。

1.3.9 流式细胞术检测CD8+T细胞对转染siPD-L1后的U87 MG细胞凋亡的影响

U87 MG细胞分别经lipofectamine 2000转染siNC,siPD-L1-PC,siPD-L1-1~ 10等48 h后,每孔加入约4×104人CD8+T细胞共同孵育。24 h后,消化各组细胞,PBS清洗两遍,加入5 μL Annexin V-FITC,5 μLPI后,4 ℃,孵育15 min,上机检测。

1.3.10 CCK-8检测CD8+T细胞对转染siPD-L1后的U87 MG细胞增殖的影响

U87 MG细胞分别经lipofectamine 2000转染siNC,siPD-L1-PC,siPD-L1-1~ 10等48 h后,每孔加入约4×104 CD8+T细胞共同孵育。24 h后,PBS清洗2遍,洗去T细胞,加入CCK-8试剂孵育1 h后,在450 nm波长进行上机检测。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件分析,数据均以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,检验水准为α=0.05,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 核苷酸序列

采用siRNA设计法则并结合计算机辅助设计软件所设计候选的siRNA靶序列、正义链和反义链中含有的核苷酸序列(表 1)。

表 1 候选的siRNA靶序列、正义链和反义链中含有的核苷酸序列 Table 1 Nucleotide sequences contained in candidate siRNAtarget sequences, sense and antisense strands
2.2 U87 MG细胞PD-L1 mRNA的表达量

RT-qPCR验证siPD-L1-1~10在U87 MG细胞中沉默PD-L1 mRNA效率,实验结果如图 1所示,在mRNA水平,与Control组比,siPD-L1-1、siPD-L1-2 siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8均显著沉默PD-L1基因mRNA的表达(P < 0.05),其效果与siPD-L1-PC作用类似。

图 1 RT-qPCR检测U87 MG细胞中PD-L1的mRNA表达 Figure 1 Expression of PD-L1 mRNA levels in transfected U87 MG cells detected by RT-qPCR. *P < 0.05 vs control.
2.3 U87 MG细胞PD-L1蛋白的表达量

Western blot验证siPD-L1-NC、siPD-L1-PC、siPDL1-3、siPD-L1-5和siPD-L1-8在U87 MG细胞中沉默PD-L1效率,实验结果如图 2所示,在蛋白水平,与Control组比,siPD-L1-3、siPD-L1-5及siPD-L1-8均显著沉默PD-L1基因蛋白的表达(P < 0.05),其效果与siPD-L1-PC作用类似。

图 2 U87 MG细胞中PD-L1的蛋白表达量 Figure 2 Expression of PD- L1 protein in transfected U87 MG cells. A: Western blotting for PD-L1 expression; B: Quantitative analysis of PD-L1 protein levels. *P < 0.05 vs control.
2.4 U87 MG细胞表面PD-L1蛋白表达量

流式细胞术验证siPD-L1-1~10在U87 MG细胞中沉默PD-L1蛋白效率,结果如图 3所示,在蛋白水平,与Control组比,siPD-L1-1、siPD-L1-2 siPD-L1-3、siPDL1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8均显著沉默PD-L1蛋白的表达(P < 0.05),其效果与siPD-L1-PC作用类似。以siPD-L1-3、siPD-L1-5及siPD-L1-8效果较佳,并对这3条序列进行后续的细胞功能研究。其中siPD-L1-3沉默效率最高,剩余PD-L1蛋白表达量为44.8%。

图 3 U87 MG细胞表面PD-L1蛋白表达量 Figure 3 PD-L1 protein expression on U87 MG cell surface detected by flow cytometry (A) and quantitative analysis (B). *P < 0.05 vs control.
2.5 siPD-L1可显著增强人CD8+T细胞对U87 MG细胞的杀伤作用

流式细胞术验证,转染相应的siPD-L1序列沉默PD-L1后,研究人CD8+T细胞对U87 MG细胞的杀伤作用。实验结果如图 4显示,与对照组相比,siPD-L1-3和siPD-L1-8均明显增强CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用(P < 0.05),其中siPD-L1-3的作用最为显著,凋亡率为33%。

图 4 U87 MG细胞凋亡率 Figure 4 Apoptotic rate of transfected U87 MG cells incubated with human CD8+T lymphocytes. A: Results of flow cytometry; B: Quantitative analysis of the results. *P < 0.05 vs control.
2.6 siPD-L1可显著增强人CD8+T细胞对U87MG细胞增殖的抑制

CCK-8实验检测转染相应的siPD-L1序列沉默PD-L1后,研究人CD8+T细胞对U87MG细胞增殖抑制作用。实验结果如图 5显示,与对照组相比,siPD-L1-3和siPD-L1-8均明显增强CD8+T细胞对肿瘤细胞增殖的抑制(P < 0.05),其中siPD-L1-3的作用最为显著,抑制率可达60%。

图 5 CCK-8检测U87 MG细胞增殖情况 Figure 5 Proliferation of transfected U87 MG cells incubated with human CD8+T lymphocytes detected by CCK-8 assay. *P < 0.05 vs control.
3 讨论

研究发现,在神经胶质瘤患者体内,PD-L1的高表达能够增强肿瘤的转移及免疫逃逸能力,导致患者死亡率上升[19-20]。因此,设计小分子抑制剂、抗体或者siRNA抑制PD-1或PD-L1通路,从而利用机体T细胞直接杀灭肿瘤细胞,已成为肿瘤免疫疗法的热点[21-22]

RNA干扰效应分子有micro RNA和siRNA等[23]。而siRNA因其效率高,且通过简单的化学合成即可获得,因而具有治疗疾病的应用前景[24-25]。目前国内外关于PD-L1及siRNA均有了较深入的研究,但是将两者结合起来研究的则甚少[26-27]。本研究利用siDirect在线设计,并通过运用BLAST在Genbank中进行同源性分析排除了与非靶基因有大于或等于15个碱基匹配的序列,双链Tm小于21.5 ℃,从而得到了10条候选siRNA序列,通过化学合成的方法获得候选siRNA分子。但由于mRNA可能存在二级结构,或者存在一些蛋白或核糖体的粘附,使得并不是所有候选序列都具有RNA干扰作用[28]。因此,需要通过实验筛选而得到最佳的siRNA序列。本实验采用阳离子脂质体法(lipofectamine 2000),通过带正电的脂质体,与核酸带负电的磷酸骨架形成复合物,也能被表面带负电荷的细胞膜吸附,通过膜的融合或细胞内吞作用导入细胞内[23]。此法因其简单方便,细胞毒性低,重复性高,可以在siRNA浓度较低的条件下转染。

本文筛选出6条高效特异性沉默PD-L1表达的siRNA序列。通过RT-qPCR、Western blot及流式细胞术实验得出,与对照组相比,siPD-L1-1、siPD-L1-2、siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8均能显著沉默PD-L1的mRNA及蛋白表达,并且可显著增强CD8+T细胞的杀伤作用,其中siPD-L1-3序列沉默活性最佳,且该序列比专利(专利号US20170067060)提供的siRNA序列(siPD-L1-PC)活性要佳。以siPD-L1-3序列转染U87 MG细胞后,使得CD8+T细胞引起肿瘤细胞的凋亡率达33%,且肿瘤细胞生长的抑制率可达60%。这可能与siPD-L1-3的GC含量适中,Tm值符合要求,且能避开mRNA二级结构及核糖体粘附区域有关。因此,本研究进一步丰富了siRNA序列的设计规则,将为设计高效沉默基因的siRNA序列提供思路。此外,本研究设计siRNA分子能够有效降低肿瘤细胞表面PD-L1蛋白的表达水平,可解除或减弱PD-L1对CD8+T细胞的抑制,从而促进T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤,抑制肿瘤生长。可利用该原理,构建合适的体内给药系统,把siPD-L1序列,递送至胶质瘤细胞内,从而获得新的胶质瘤治疗方法[29-30]。综上所述,本研究设计并筛选出了一条全新的可特异性高效沉默PD-L1 mRNA的siRNA序列,该序列未见国内外文献及专利报道过,其沉默PD-L1mRNA表达的效价高于专利报道的水平,为后续开发抗肿瘤药物奠定了基础。

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