雌激素受体阳性的乳腺癌细胞缝隙连接的调控对阿霉素抗肿瘤作用的影响
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  南方医科大学学报  2018, Vol. 38Issue (7): 780-786  DOI: 10.3969/j.issn.1673-4254.2018.07.02.
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蒋国君, 刘亚明, 赵婉晨, 王道鑫, 董淑英, 童旭辉. 雌激素受体阳性的乳腺癌细胞缝隙连接的调控对阿霉素抗肿瘤作用的影响[J]. 南方医科大学学报, 2018, 38(7): 780-786. DOI: 10.3969/j.issn.1673-4254.2018.07.02.
JIANG Guojun, LIU Yaming, ZHAO Wanchen, WANG Daoxin, DONG Shuying, TONG Xuhui. Effect of gap junction modulation on antitumor effects of adriamycin in estrogen receptor-positive breast cancer cells[J]. Journal of Southern Medical University, 2018, 38(7): 780-786. DOI: 10.3969/j.issn.1673-4254.2018.07.02.

基金项目

国家自然科学基金(81001457);安徽省自然科学基金(1808085QH269);蚌埠医学院科研课题重点项目(BYKY1605ZD、BYKY1608ZD); 安徽省大学生创新创业训练项目(201710367012)

作者简介

蒋国君,硕士,E-mail: kinly1006@163.com

通信作者

童旭辉,博士,教授,电话:0552-3179525,E-mail: bbmctxh@126.com

文章历史

收稿日期:2018-03-13
雌激素受体阳性的乳腺癌细胞缝隙连接的调控对阿霉素抗肿瘤作用的影响
蒋国君 , 刘亚明 , 赵婉晨 , 王道鑫 , 董淑英 , 童旭辉     
蚌埠医学院药学院药理教研室,安徽 蚌埠 233030
摘要: 目的 在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞MCF-7中观察缝隙连接(GJ)功能的调控对阿霉素抗肿瘤作用的影响。方法 采用MTT法检测0~24.0 μmol/L阿霉素对细胞存活率的影响;Western blot和细胞免疫荧光法分别检测细胞中Cx43总蛋白和膜蛋白的表达;细胞接种荧光示踪法检测细胞缝隙连接功能;采用维甲酸增强细胞GJ功能,油酸酰胺和18-alpha-甘草次酸(18-α-GA)抑制细胞GJ功能;Cx43siRNA沉默细胞中Cx43基因。结果 雌激素受体阳性(ER+)细胞中Cx43表达水平及GJ功能显著强于雌激素受体阴性ER(-)细胞,阿霉素显著抑制MCF-7细胞的增殖(P < 0.01),维甲酸可以通过增加细胞GJ功能从而增强阿霉素的细胞毒性(P < 0.01),油酸酰胺和18-α-GA可通过抑制细胞GJ功能而降低阿霉素的细胞毒性(P < 0.01);采用siRNA沉默细胞Cx43基因,胞内Cx43总蛋白和膜蛋白表达下降,GJ功能降低,阿霉素对MCF-7的细胞毒性降低(P < 0.01)。结论 ER(+)细胞中Cx43表达水平及GJ功能显著强于ER(-)细胞;维甲酸可以通过增强细胞GJ功能而增加阿霉素细胞毒性,油酸酰胺和18-α-GA通过抑制细胞GJ功能降低阿霉素细胞毒性,Cx43siRNA能沉默MCF-7中Cx43表达,并抑制由其形成的GJ功能,降低阿霉素的细胞毒性。
关键词: 乳腺癌    缝隙连接    维甲酸    油酸酰胺    阿霉素    
Effect of gap junction modulation on antitumor effects of adriamycin in estrogen receptor-positive breast cancer cells
JIANG Guojun, LIU Yaming, ZHAO Wanchen, WANG Daoxin, DONG Shuying, TONG Xuhui     
Pharmacology department of Bengbu Medical college, Bengbu 233030, China
Supported by National Natural Science Foundation of China (81001457)
Abstract: Objective To observe the effect of functional modulation of gap junctions (GJ) on the antitumor effect of adriamycin in breast cancer cells positive for estrogen receptor (ER). Methods The inhibitory effect of 0 to 24.0 μmol/L adriamycin on the surviving fraction of ER-positive human breast cancer MCF-7 cells and ER-negative MDA-MB-231 cells was assessed with MTT assay; Western blotting and immunofluorescence assay were used to detect the expressions of Cx43 total protein and membrane protein in the cells. A parachute assay was used to evaluate the function of the GJ in MCF-7 cells. The cytotoxic effect of adriamycin was observed in the cells treated with retinoic acid (RA) for enhancing GJ function, in cells treated with oleamide and 18-α- glycyrrhizic acid (18-α-ga) for inhibiting GJ function, and also in cells transfected with Cx43siRNA for Cx43 knockdown. Results ER-positive MCF-7 cells expressed a significantly higher level of Cx43 with stronger GJ function than ER-negative MDA- MB-231 cells. Adriamycin significantly inhibited the proliferation of MCF-7 cells (P < 0.01), and RA treatment further increased the cytotoxicity of adriamycin (P < 0.01) while oleamide and 18-α-GA obviously attenuated the cytotoxicity of adriamycin (P < 0.01). In the cells with Cx43 knockdown, the expressions of total Cx43 protein and Cx43 on the membrane were significantly reduced, the function of GJ was attenuated, and the cytotoxicity of adriamycin was significantly decreased (P < 0.01). Conclusions ER-positive breast cancer cells have stronger Cx43 expressions and GJ function than the ERnegative cells. The cytotoxicity of adriamycin against the breast cancer cells can be strengthened by enhancing GJ function and attenuated by inhibiting GJ function. Cx43 silencing inhibits the function of GJ to lower the cytotoxicity of adriamycin in human breast cancer MCF-7 cells.
Key words: breast cancer    gap junctions    retinoic acid    oleamide    adriamycin    

乳腺癌是危害女性健康的恶性肿瘤之一,往往成为致死的主要病因。在乳腺癌的治疗中,除了手术、放射和内分泌治疗以外,还有非常重要的化学药物辅助治疗[1]。阿霉素是治疗乳腺癌的经典药物,但是心脏毒性等不良反应均限制了它在临床的应用,因此寻找增强阿霉素抗肿瘤活性,并降低不良反应的方法迫在眉睫[2]

缝隙连接(GJ)是细胞与细胞之间物质交换的重要通道,由连接蛋白(Cx)组成[3]。研究表明在肿瘤的产生和发展中,Cx的表达通常会下降或缺失,而通过增加细胞Cx的表达可以依赖或不依赖细胞GJ从而抑制肿瘤细胞增殖,促进其凋亡[4]。也有研究表明,Cx可能会促进晚期肿瘤的外渗和转移[5]。在乳腺上皮细胞中以Cx43、Cx26等表达水平较高,本课题组前期研究也证明,在肿瘤细胞中,对GJ的调控可以影响化疗药物的抗肿瘤作用,且Cx43表达水平与肿瘤的恶性程度有一定的相关性[6]。然而,目前尚无文献报道在雌激素受体阳性(ER+)的乳腺癌细胞和雌激素受体阴性(ER-)的细胞中比较Cx43蛋白的表达和GJ功能,并通过对GJ功能的调控观察阿霉素对两种不同性质乳腺癌细胞毒性的影响。因此,本研究将首先比较ER(+)的MCF-7细胞和ER(-)的MDA-MB-231细胞中Cx43蛋白的表达及GJ功能。然后分别采用药理学和分子生物学两种方法调控MCF-7细胞的GJ功能,观察对阿霉素抗乳腺癌作用的影响。本实验将从增强细胞GJ功能和抑制GJ功能两个角度分别探讨对阿霉素毒性的影响,并进一步通过沉默Cx43基因,观察对GJ功能及阿霉素抗肿瘤作用的影响。以期为ER(+)的乳腺癌细胞临床治疗提供新靶点,扩大阿霉素的临床应用。

1 材料和方法 1.1 材料

细胞株MCF-7、MDA-MB-231细胞购自上海细胞库,由蚌埠医学院药理实验室冻存。阿霉素、维甲酸、油酸酰胺、18- alpha -甘草次酸、胰酶、MTT、二甲基亚砜均购于美国Sigma;DMEM高糖培养基、胎牛血清、荧光染料calcein-AM购于美国Gibco。阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000、Opti-MEM培养基、ECL发光试剂盒购于Invitrogen;Cx43单克隆抗体为美国Sigma产品,羊抗鼠β-actin单克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体均购自Bio-Rad。其他试剂均是国产分析纯级。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养

ER(+)乳腺癌MCF-7细胞培养于MEM培养基,ER(-)乳腺癌MDA-MB-231细胞培养于DMEM高糖培养基,分别含有10%(V/V)胎牛血清、0.01 mg/mL人胰岛素、100 U/mL青霉素,100 mg/L链霉素,放置于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养。传代时采用0.25%胰蛋白酶溶液,1周传代2~3次,传代比例约为1: 3。

1.2.2 MTT检测GJ功能的调控对阿霉素抗肿瘤作用的影响

将细胞按5×104 /mL的密度接种于96孔板,每组设5个复孔。细胞经GJ功能药物预处理(RA:24 h,oleamide:1 h,18-α-GA:1 h)后,再用阿霉素刺激24 h,检测细胞存活率。另设阴性对照组(不加药物)和空白对照组(不加细胞,只加培养基)。终止培养前4 h,每孔加MTT 15 μL(5 g/L)37 ℃下孵育,检测前弃上清,加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL /孔,37 ℃下孵育30 min,微量振荡器震摇8 min,酶标仪测定每孔在A490nm处的吸光度值,实验重复4次。

1.2.3 Western blotting检测细胞中Cx43总蛋白的表达

收集MCF-7和MDA-MB-231细胞,冰上裂解30 min,提取总蛋白,BCA蛋白定量法测各组蛋白浓度,用细胞裂解液配平各组蛋白浓度,与2×上样缓冲液1:1混合,100 ℃下煮沸5 min使蛋白变性。经SDS-PAGE电泳(10%分离胶)分离后电转至PVDF膜上。脱脂牛奶室温下封闭2 h;Cx43一抗采用Western blotting一抗稀释液按1: 5000的比例稀释,4 ℃下孵育过夜;摇床上用TPBS洗10 min×3次;羊抗鼠lgG二抗用脱脂牛奶按1:4000稀释,室温下孵育2 h;TPBS洗10 min×3次;ECL试剂盒避光下显影曝光。Bio-Rad凝胶成像系统采集图像。以β-actin为内参对照。

1.2.4 细胞免疫荧光法观察细胞膜Cx43蛋白表达

以5×104 /mL的密度将MCF-7和MDA-MB-231细胞接种于六孔板中盖玻片上,培养箱中培养2 d,吸去培养基,PBS洗5 min×2次;4%多聚甲醛-0.1% Triton溶液室温下固定细胞10 min,PBS洗10 min×2次;1% BSA封片2 h;Cx43一抗用一抗稀释液按1:500的比例稀释,4 ℃孵育过夜(勿摇晃),PBS洗10 min×3次;二抗用TPBS按1:200稀释,放置37 ℃下湿盒中孵育2 h,PBS洗10 min×3次;碳酸甘油缓冲液封片,倒置荧光显微镜观察、拍照。

1.2.5 细胞接种荧光示踪法测定MCF-7细胞间GJ功能

将两株细胞以10×104 /mL的密度接种于十二孔板内,药物处理后,将荧光指示剂calcine-AM与其中一孔细胞共同孵育,calcine-AM可以通过GJ通道进入细胞浆内。该细胞称为“供体细胞”。然后将“供体细胞”接种到已生长融合(有条件形成GJ)的细胞中,培养4 h。待供体细胞贴壁,并与相邻细胞形成稳定的GJ后,小分子的calcine-AM(发绿色荧光)可以通过GJ进入相邻的细胞。实验结果采用倒置荧光显微镜观察,以一个“供体细胞”周围含有绿色荧光的细胞数量多少作为GJ功能指标[7]

1.2.6 siRNA序列的设计与合成

针对人源Cx43基因小分子干扰RNA片段由上海吉玛公司设计合成。Cx43siRNA和阴性对照siRNA序列分别为:Cx43siRNA:(正义链):5'-GGAAGCACCAUCUCUA ACUTT-3',(反义链):5'-AGUUAGAGAUGGUGCUU CCTT-3';Negative control:(正义链):5'-GGCCUUG AAUAUCAUUGAATT-3',(反义链):5'-UUCAAUGA UAUUCAAGGCCTT-3'。SiRNA序列作BLAST比对,以保证和其他基因没有同源性,siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.2.7 统计学分析

实验结果使用SPSS 11.0软件进行分析。资料以均数±标准差表示,两组之间计量资料比较采用t检验,统计图表采用Sigma Plot 12.0绘制,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 MCF-7和MDA-MB-231细胞中Cx43蛋白的表达及细胞GJ功能

Western blotting结果表明,MCF-7细胞中Cx43的总蛋白表达水平显著高于MDA-MB-231细胞(图 1A);细胞免疫荧光结果显示,ER(+)的乳腺癌MCF-7细胞胞膜Cx43绿色荧光比ER(-)乳腺癌细胞MDA-MB-231更强,在MDA-MB-231细胞膜上只见到极少数的绿色荧光斑(图 1B);MCF-7细胞的GJ功能显著高于MDAMB-231细胞(图 1CD)。

图 1 MCF-7和MDA-MB-231细胞Cx43蛋白表达水平及GJ功能 Figure 1 Expression of Cx43 and function of gap junction in MCF-7 and MDA-MB-231 cells. A: Total Cx43 protein detected by Western blotting; B: Expression of Cx43 on the cell membrane (Original magnification: × 400); C: Function of gap junction assessed by parachute dye-coupling assay (×400); D: Bar chart of the results of the parachute assay. **P < 0.01 vs MCF-7 cells.
2.2 阿霉素对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231存活率的影响

选用0~24.0 μmol/L的阿霉素作用于MCF-7和MDA-MB-231细胞24 h后,MTT结果显示:随着药物浓度的提高,两珠细胞的存活率明显下降。24.0 μmol/L阿霉素作用于MCF-7细胞24、36、48 h后,细胞存活率分别为56.35%、51.36%、44.89%。阿霉素作用于MDAMB-231细胞24、48、72 h后,细胞存活率分别为69.25%、42.43%、97.96%(图 2)。

图 2 阿霉素对MCF-7和MDA-MB-231细胞24、36、48 h存活率的影响 Figure 2 Surviving fraction of MCF-7 and MDA-MB-231 cells treated with adriamycin for 24, 36, and 48 h (MTT assay, n=4). A: Surviving fraction of MCF-7 cells treated with 0 to 24.0 μmol/L adriamycin. **P < 0.01 vs 0 μmol/L adriamycin group; B: Surviving fraction of MDA-MB-231 cells treated with 0 to 24.0 μmol/L adriamycin. **P < 0.01 vs 0 μmol/L adriamycin group.
2.3 RA增强阿霉素对MCF-7细胞的毒性作用

在MCF-7细胞中,用10.0 μmol/L的RA(此浓度RA对细胞无毒性)预处理24 h,细胞接种荧光示踪法结果显示,与对照组相比,RA预处理后的细胞荧光传递增强了112.86%(图 3A)。图 3B结果显示,高密度接种细胞时(细胞生长融合,有GJ形成),6.0 μmol/L的阿霉素作用于细胞24 h的细胞存活率为0.64±0.03,而10.0 μmol/L的RA预处理24 h,再用阿霉素刺激细胞24 h,MCF-7细胞存活率为0.43±0.04,低于阿霉素单用组,差异有统计学意义(P < 0.01)。而在低密度接种的细胞(细胞生长未融合,无GJ形成),用RA预处理组的细胞存活率(0.56±0.03)与阿霉素单用组(0.52±0.04)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。

图 3 维甲酸在MCF-7细胞中增强阿霉素的细胞毒性 Figure 3 Retinoic acid increased the cytotoxicity of adriamycin (ADM) in MCF-7 cells (n=4, Mean±SD). A: Fluorescence images (×400) showing dye coupling in parachute assay and quantitative analysis. **P < 0.01 vs control group; B: Retinoic acid increased the antitumor activity of cisplatin in A549/CDDP cells with high- or low-density GJ. **P < 0.01 vs ADM group.
2.4 油酸酰胺(oleamide)和18-α-GA降低阿霉素对MCF-7细胞的毒性作用

选用oleamide和18-α-GA两种GJ功能抑制剂预处理细胞,细胞接种荧光示踪法结果显示:25.0 μmol/L oleamide和10.0 μmol/L 18-α-GA分别预处理MCF-7细胞1 h,细胞荧光传递分别降低了70.24%和33.62%(图 4A)。接着采用高低密度接种法,观察25.0 μmol/L oleamide和10.0 μmol/L 18-α-GA预处理后对阿霉素细胞毒性的影响。在高密度接种细胞时(细胞生长融合,有GJ形成),6.0 μmol/L的阿霉素作用于细胞24 h的细胞存活率为0.69±0.03,而25.0 μmol/L的oleamide和10.0 μmol/L18-α-GA分别预处理细胞1 h,再用6.0 μmol/L的阿霉素刺激细胞24 h,MCF-7细胞存活率分别为0.86 ±0.04、0.83±0.07,均显著高于阿霉素单用组(P < 0.01,图 4B)。而在低密度接种的细胞(细胞生长未融合,无GJ形成),用oleamide和18-α-GA预处理组的细胞存活率分别为0.50±0.03、0.53±0.06与阿霉素单用组(0.54± 0.04)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。

图 4 油酸酰胺和18-α-甘草次酸在MCF-7细胞中降低阿霉素的细胞毒性 Figure 4 Oleamide and 18-α-GA decreased the cytotoxicity of adriamycin (ADM) in MCF-7 cells (n=4, Mean± SD). A: Fluorescence images of parachute dye-coupling assay (× 400). **P < 0.01 vs control group; B: Oleamide and 18-α-GA decreased the antitumor activity of cisplatin in A549/CDDP cells with high-or low-density GJ. **P < 0.01.
2.5 SiRNA降低阿霉素对MCF-7细胞的毒性作用

Western blot结果显示,将Cx43siRNA转染入MCF-7细胞后,Cx43蛋白表达显著降低。细胞免疫荧光法结果显示,转染了siRNA后,MCF-7细胞膜的Cx43蛋白表达显著降低(图 5AB)。在高密度接种的细胞(细胞生长融合,有GJ形成),单用阿霉素组细胞的存活率为68.85±0.03,siRNA沉默Cx43后,使MCF-7细胞GJ功能减弱,与单用阿霉素组相比,细胞存活率增加84.23±0.05(P < 0.01)。阴性对照组细胞存活率为98.02±0.02,与单用阿霉素组比较差异无统计学意义(P>0.05)。在低密度接种的细胞(生长未融合,无GJ形成),与单用阿霉素相比,Cx43siRNA对阿霉素的细胞存活率无明显影响(P>0.05,图 5CD)。

图 5 Cx43siRNA在MCF-7细胞中降低阿霉素的抗肿瘤作用 Figure 5 Cx43 siRNA decreased the cytotoxicity of adriamycin (ADM) in MCF-7 cells (n=4, Mean±SD). A: Expression level of Cx43 detected by Western blotting; B: Immunofluorescence assay of expression of Cx43 on the membrane; C: Fluorescence images of parachute dye-coupling assay (×400). **P < 0.01 vs control group; D: Cx43siRNA decreased the antitumor activity of adriamycin in A549/CDDP cells with high-or low-density GJ. **P < 0.01 vs the control group. ##P < 0.01 vs the ADM group.
3 讨论

目前对细胞缝隙连接调控的方式主要有工具药物和基因沉默/过表达[8],药物诱导主要是通过文献查阅的比较公认的工具药物,如RA [9]、维生素A、黄芩素[7]等,增强细胞GJ功能,从而加强细胞间的物质交流,课题组前期研究证明黄芩素可以通过增加细胞Cx43蛋白的表达从而增强睾丸间质细胞TM4的GJ功能;而目的基因转染也是常用的恢复和上调肿瘤细胞GJ功能的方法。黄酮类药物黄连素在肺腺癌A549细胞中可以通过增加Cx43蛋白的表达从而增强顺铂的抗肿瘤作用。这表明,化疗药物的抗肿瘤作用可以通过调控细胞GJ功能来实现。

乳腺癌的发病率在所有女性恶性肿瘤中占首位,阿霉素是乳腺癌治疗的经典药物,但心脏毒性等不良反应比较严重,且长期使用以后,乳腺癌对其敏感性下降均在很大程度上影响了乳腺癌的治疗[10]。因此,找到增强阿霉素抗肿瘤作用的方法对于临床乳腺癌的治疗至关重要。雌激素受体是影响乳腺癌患者主要的预后因素之一,目前对乳腺癌的分型常用指标为:ER和孕激素受体(PR)等。通常ER(+)的乳腺癌恶性程度较低,预后较好[11-12]。在ER(+)的原发性乳腺癌中,Cx43mRNA的表达可以与肿瘤的抑制相关,而对ER(-)的乳腺癌却起到相反的保护作用[13]。Cx43对肿瘤生长的潜在控制可能有助于ER(+)乳腺肿瘤更好地分化和患者生存质量的提高[14]。在ER(-)乳腺癌中,其他途径比Cx43的表达更占主导地位,如Wnt-1和/或Ras-Raf-MAPK活化,它们负责分化出较差的表型、导致更差的预后[15]。本研究结果显示,在细胞水平中,ER(+)的乳腺癌中Cx43表达水平显著高于ER(-)的乳腺癌。但在ER(+)的乳腺癌中,从调控GJ功能及Cx蛋白的角度来治疗乳腺癌的研究尚缺乏,因此,本实验开展了一系列的实验。

正常乳腺组织表达Cx26、Cx32和Cx43等连接蛋白,其中Cx43是乳腺组织中含量较丰富的蛋白,且被广泛研究[4, 6]。本实验结果表明,在ER(+)的MCF-7乳腺癌细胞中Cx43蛋白的表达水平高于ER(-)的MDAMB-231细胞,且由Cx43形成GJ的功能也显著增强,MDA-MB-231细胞中几乎不表达Cx43。这表明,Cx43在乳腺癌细胞中的表达可能与ER的表达水平相关。于是后续研究将集中在ER(+)的MCF-7细胞中,通过调控细胞GJ功能观察对阿霉素抗肿瘤作用的影响。

肿瘤细胞中的Cx往往会缺失,而恢复Cx的表达可以增加肿瘤细胞的死亡[4, 16]。在间皮瘤细胞中,Cx43表达增多可以增强顺铂的细胞毒性[17],这表明,细胞中Cx43的表达对化疗药物敏感性密切相关。但是该过程是否与GJ的形成有关呢,我们不得而知,因此本实验采用了高低密度接种细胞的方法。GJ形成需要细胞与细胞之间相互接触,接触越紧密,形成的GJ越多,调控GJ后效果就越显著。

单独用药可以治疗鳞状细胞癌和黑色素瘤等肿瘤[18-19]。课题组前期研究表明,RA在不影响细胞增殖的情况下可以增强细胞GJ功能,从而影响化疗药物的细胞毒性[6]。本实验同样采用对MCF-7细胞无毒性的10.0 μmol/L的RA预处理24 h,结果表明RA可以增强细胞GJ功能,并增加阿霉素的抗乳腺癌作用。

Oleamide的作用机制仍不明确,可能是通过抑制Ca2+通过GJ进入细胞,从而抑制细胞的死亡[20]。研究表明其衍生物MI-22等可以通过下调细胞Cx26的表达,从而抑制GJIC,阻碍细胞的侵袭转移[21]。在转染了Cx32/Cx26的宫颈癌细胞Hela中,经多西环素的诱导后,加入GJ抑制剂18-α-GA,能显著降低顺铂和奥沙利铂的细胞敏感性[22]。但是对于oleamide和18-α-GA能否影响乳腺癌MCF-7细胞中由Cx43形成的GJ功能不得而知。本研究证明oleamide和18-α-GA可以显著抑制MCF-7细胞GJ功能,从而降低阿霉素对MCF-7的毒性。药物可以通过改变Cx的结构、数量及分布,或直接调控GJ功能调控细胞GJ功能[4, 23]。Oleamide和18-α-GA主要是通过改变细胞GJ的“门控”功能,即通透性而产生的。

为了排除药物可能通过其他途径影响细胞GJ功能[24],本实验选择采用siRNA从基因水平特异性地沉默Cx43。结果表明,SiRNA干扰后的MCF-7细胞中Cx43总蛋白和细胞膜蛋白表达均显著降低,细胞间GJ功能和阿霉素的毒性也均显著降低。这进一步证实Cx43在乳腺癌的发生发展中,扮演着抑癌基因的角色[25]。微小RNA(microRNA)对Cx43的调控也逐渐成为热门的研究靶点[25-29],大鼠大脑缺血后处理可以通过下调miRNA-1影响Cx43蛋白的重新分布[30]

综上所述,本文首先发现了ER(+)的乳腺癌细胞中Cx43总蛋白、细胞膜蛋白的表达水平均高于ER(-)细胞,且ER(+)细胞中由Cx43形成的GJ功能显著强于ER(-)细胞。其次,在ER(+)细胞MCF-7中通过调控GJ功能,观察了对阿霉素抗肿瘤作用的影响。本研究可为阿霉素的临床扩大应用、ER(+)乳腺癌的临床治疗提供新靶点。

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